蛋白樣品制備詳解—酶類篇

   當(dāng)細(xì)胞破碎的時(shí)候，蛋白水解酶就會(huì)被釋放出來或被激活，使電泳結(jié)果復(fù)雜化，影響最終結(jié)果分析。為了避免這些情況的出現(xiàn)，建議在樣品制備時(shí)盡可能在低溫下進(jìn)行。此外，許多蛋白酶在PH9以上就失活了，因此Tris堿，碳酸鈉或堿性載體兩性電解質(zhì)往往能抑制蛋白水解。但是有些蛋白酶在上述條件下仍然保持著活性，此時(shí)應(yīng)當(dāng)使用蛋白酶抑制劑。因此對(duì)于我們想要研究的蛋白來說，選擇性和有效的抑制這些蛋白酶對(duì)于蛋白純化路線設(shè)計(jì)來說顯得尤為重要。

  蛋白酶抑制劑與蛋白酶一樣，都是紛繁復(fù)雜的，通常使用許多化學(xué)物質(zhì)作為蛋白酶抑制劑，如PMSF 和leupeptin。而且由于一種蛋白酶抑制劑只對(duì)某一類蛋白酶起作用，因此通常建議復(fù)合使用蛋白酶抑制劑，如廣譜蛋白酶抑制劑“雞尾酒"。

  但是這樣配置溶液進(jìn)行處理，有時(shí)也是頗為麻煩，而且效果可能并不好，目前有一些廠家試劑在簡便操作，和抑制效果方面有不俗的表現(xiàn)，可以考慮在實(shí)驗(yàn)中選用，節(jié)約時(shí)間和便于結(jié)果分析。

  比如，G-Biosciences的ProteaseArrest™蛋白酶抑制劑也許就能滿足這種需要，ProteaseArrest™是一種常規(guī)的蛋白酶抑制劑混合物，提供100X濃縮的即用溶液。這種100X濃度的溶液適用于小量，分析樣本的應(yīng)用。在1ml樣本中加入10微升的ProteaseArrest可以達(dá)到大于95%的抑制效率。對(duì)于樣本中含量高的蛋白酶的情況，可以適當(dāng)增加ProteaseArrest的量來達(dá)到更大的抑制效率。

  抑制劑混合物包括針對(duì)絲氨酸、半胱氨酸、鈣蛋白酶和金屬蛋白酶可實(shí)現(xiàn)可逆和不可逆的抑制。可選擇的EDTA的溶液可實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)的金屬蛋白酶的抑制。EDTA并不存在于ProteaseArrest混合物溶液中，它將抑制那些需要二價(jià)陽離子（Ca2+, Mg2+ 或Mn2+）來起作用的蛋白質(zhì)的活性。除此之外，EDTA會(huì)抑制那些通過使用固定金屬親和層析色譜純化得到的蛋白，也包括6XHis標(biāo)簽重組蛋白。

  由于各種抑制劑組分的*化的濃度，ProteaseArrest表現(xiàn)出優(yōu)異的蛋白酶活性的抑制，因而它適合在從動(dòng)物組織，酵母，植物和細(xì)菌中進(jìn)行蛋白純化和樣本制備過程中來保護(hù)蛋白。

  ProteaseArrest也有獨(dú)立包裝的小包裝，能夠在10ml的溶液中達(dá)到大于95%的抑制效率。這種OneQuant™小包裝主要是為了科研人員方便使用。

  實(shí)重要的是ProteaseArrest也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的情況來優(yōu)化蛋白酶抑制劑的濃度，比如組織中含有高于常規(guī)量的蛋白酶的時(shí)候，可以加入2X或者更高濃度的ProteaseArrest的量。

在研究中，發(fā)現(xiàn)1X濃度的ProteaseArrest的蛋白酶抑制效率達(dá)到了95%（0.5mg/ml的小鼠的胰腺提取物為例）。

  除了蛋白酶抑制劑以外，在許多研究過程中，尤其是一些制藥公司和研究院在研究藥理學(xué)機(jī)制的時(shí)候，需要了解蛋白磷酸化途徑，因此一個(gè)重要的步驟就是準(zhǔn)確的觀察一般和特異的磷酸化狀態(tài)，所以蛋白抽提的另一個(gè)重要保護(hù)過程就是對(duì)磷酸化狀態(tài)的有效保護(hù)。

  磷酸化的蛋白可以被非特異性的磷酸酶（例如：堿性磷酸酶），特異性的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶、酪氨酸蛋白磷酸酶或雙重特異性磷酸酶去磷酸化。針對(duì)這種情況G-Biosciences也推出了一種PhosphataseArrest™磷酸酶抑制劑混合物，它能夠保持細(xì)胞和組織中蛋白的磷酸化狀態(tài)。PhosphataseArrest™包括3種抑制劑產(chǎn)品。

phosphataseArrest™ I

一種廣泛的磷酸酶抑制劑混合物包括5種磷酸酶抑制劑，能夠特異性的抑制絲氨酸/蘇氨酸，和酪氨酸雙重特異性的磷酸酶。PhosphataseArrest™ I是一種穩(wěn)定的溶液組成，含有氟化鈉，正釩酸鈉，焦磷酸鈉，β-磷酸甘油，鉬酸鹽等。

PhosphataseArrest™ II

一種廣泛的磷酸酶抑制劑混合物包括5種磷酸酶的抑制劑能夠抑制酸性，堿性和酪氨酸磷酸酶。PhosphataseArrest™ II含有優(yōu)化濃度的氟化鈉，酒石酸鈉，正釩酸鈉，咪唑和鉬酸鹽。

PhosphataseArrest™ III

一種廣泛的磷酸酶抑制劑混合物包括3種磷酸酶的抑制劑能夠抑制堿性和絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶。PhosphataseArrest™ III是一種穩(wěn)定的，方便的溶液，由斑蝥素，對(duì)溴四咪唑草酸鹽和腫瘤促進(jìn)劑組成。

總而言之，在實(shí)驗(yàn)中適當(dāng)?shù)倪x擇一些經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量監(jiān)控的產(chǎn)品，想來相比較于家制的雞尾酒而言具有更好的使用重復(fù)性，和有效性，讓我們?cè)谙掠螒?yīng)用中得到更潔凈和清晰的結(jié)果。

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