關(guān)于免疫細(xì)胞的常用分離、純化技術(shù)

各種免疫細(xì)胞的分工與協(xié)作，共同完成免疫應(yīng)答及其調(diào)控，因此，各種免疫細(xì)胞的分離及其功能測(cè)定對(duì)于了解其在免疫應(yīng)答中的作用及相互關(guān)系有著重要意義。

免疫細(xì)胞分離的方法有很多，主要是根據(jù)細(xì)胞的理化性狀、功能，以及細(xì)胞表面標(biāo)志等的差異而設(shè)計(jì)的。粘附分離法、尼龍毛柱分離法等主要根據(jù)細(xì)胞的屬性（如粘附）和功能不同，旨在將粘附和非粘附或粘附力較小的細(xì)胞分離開。有人證實(shí)免疫細(xì)胞在玻璃或塑料平面上的粘附能力分別為：巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞＞樹突狀細(xì)胞=抗體產(chǎn)生細(xì)胞＞B淋巴細(xì)胞＞T淋巴細(xì)胞=紅細(xì)胞。粘附的細(xì)胞可通過trypsin洗脫而收集。葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法和Percoll不連續(xù)密度梯度離心法等是根據(jù)細(xì)胞的大小及比重的差異進(jìn)行細(xì)胞分離。尚可利用特異性單克隆抗體結(jié)合其它技術(shù)分選細(xì)胞，如補(bǔ)體細(xì)胞毒分離法，洗淘分離法（panning）、流式細(xì)胞術(shù)分離法，以及免疫磁珠法分離細(xì)胞技術(shù)等。一般應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的及所需細(xì)胞的種類、純度及數(shù)量等要求來確定采用何種方法。

Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）

外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral?blood?mononuclear?cell,PBMC）的分離是免疫學(xué)研究中的一項(xiàng)基本技術(shù)。

目前國(guó)內(nèi)外分離PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法（ficoll-hypaque?density?gradient?centrifugation），用此方法分離PBMC純度可達(dá)95％，淋巴細(xì)胞約占90％，其中T淋巴細(xì)胞占80％，B淋巴細(xì)胞占4～10％。ficoll-hypaque混合溶液，又稱淋巴細(xì)胞分層液，在分離人PBMC時(shí)，要求其比重為1.077；分離小鼠單個(gè)核細(xì)胞時(shí)比重為1.080；分離大鼠單個(gè)核細(xì)胞時(shí)比重為1.084～1.087；分離馬單個(gè)核細(xì)胞時(shí)比重為1.090。

免疫磁珠法分離淋巴細(xì)胞

免疫磁珠法分離細(xì)胞是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場(chǎng)中，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，無該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場(chǎng)中停留，從而使細(xì)胞得以分離。

1.根據(jù)免疫磁珠（immune?magnetic?bead，IMB）的種類，免疫磁珠法分離細(xì)胞可分為直接法和間接法。直接法即將特異性抗體與磁珠相連，IMB可與表達(dá)相應(yīng)膜抗原的細(xì)胞結(jié)合，在磁性分離器（磁架）作用下，連有磁珠的細(xì)胞被吸附在磁架上，從而與其他細(xì)胞分離。間接法即將二抗與磁珠相連，磁珠通過二抗與一抗相結(jié)合，一抗與細(xì)胞表面抗原結(jié)合，因此使磁珠與細(xì)胞相連，從而在磁場(chǎng)作用下，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離。直接法分離得到的連有磁珠的細(xì)胞可直接用于功能實(shí)驗(yàn)或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。間接法分離得到的連有磁珠的細(xì)胞須再培養(yǎng)2天，待磁珠從細(xì)胞上脫落下來，才能進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。近年來，開發(fā)了生物素標(biāo)記的單抗--親和素/鏈霉親和素—生物素結(jié)合的磁珠實(shí)驗(yàn)體系（BAB法）。利用生物素和親和素之間的高親和力及生物放大效應(yīng)來增強(qiáng)IMB與細(xì)胞的特異性結(jié)合，從而提高細(xì)胞分離效率。為了分離后迅速進(jìn)行分離效果分析，目前有研究者將熒光素（如FITC）標(biāo)記在親和素/鏈霉親和素表面，使所分離的細(xì)胞在流式細(xì)胞儀上馬上得到檢測(cè)，從而省去了免疫熒光染色的時(shí)間。

2.根據(jù)磁珠結(jié)合的細(xì)胞與所要獲得的細(xì)胞的關(guān)系，免疫磁珠法分離細(xì)胞可分為正選法和負(fù)選法。正選法即磁珠結(jié)合的細(xì)胞就是所要分離獲得的細(xì)胞，負(fù)選法即磁珠結(jié)合不需要的細(xì)胞，游離于上清液的細(xì)胞為所需細(xì)胞。還有一種基于負(fù)選法的高效分離方法，即在實(shí)驗(yàn)體系中加入連接有磁珠的多種單抗，通過磁性分離器后，則所有不需要的細(xì)胞被吸附在磁架上，未被吸附的細(xì)胞為目的細(xì)胞。這種方法可一次去除多種細(xì)胞，又稱雞尾酒法（cocktail）。

免疫磁珠法分離細(xì)胞是一種90年代初興起的新型細(xì)胞分離技術(shù)，所獲細(xì)胞純度高（93%-99%），獲率可達(dá)90%，活細(xì)胞率大于95%，且操作簡(jiǎn)單，不需使用離心沉淀分離技術(shù)，省時(shí)且費(fèi)用低。