流式細(xì)胞術(shù)之檢測(cè)工作原理

在流式細(xì)胞術(shù)中使用的儀器稱為流式細(xì)胞分析儀，通常縮寫為“細(xì)胞分析儀"。流式細(xì)胞分析儀由一個(gè)用于進(jìn)行細(xì)胞處理的流體系統(tǒng)和一個(gè)包括數(shù)據(jù)采集信號(hào)檢測(cè)器和處理器的光學(xué)系統(tǒng)組成。專為 FACS 設(shè)計(jì)的儀器還包含一個(gè)細(xì)胞分選組件，該組件可將細(xì)胞引導(dǎo)到不同的捕獲容器中。

流體系統(tǒng)設(shè)計(jì)用于生成單細(xì)胞的均勻流，以確保當(dāng)細(xì)胞被用于檢測(cè)的光源照射時(shí)，能夠進(jìn)行適當(dāng)分析。這通過使用加壓管將細(xì)胞從樣品管注入流室中來完成。從容器（通常是一根試管或一塊多孔板）中抽取細(xì)胞樣品，并將其注入流動(dòng)液體（稱為鞘液）層流中間的流室中。通過一個(gè)稱為流體動(dòng)力學(xué)聚焦的流程，鞘液可幫助縮窄細(xì)胞流，從而將細(xì)胞組織成一行大致單行的流線。

流式細(xì)胞分析儀的光學(xué)系統(tǒng)包括照明源、過濾器、透鏡和收集光學(xué)器件。照明源常包括 1 個(gè)或多個(gè)激光束，且每個(gè)激光器發(fā)射的光波長(zhǎng)不同。檢測(cè)器不區(qū)分各種光波長(zhǎng)，而是通過放置在光路徑中的過濾器來將光限制在所需波長(zhǎng)范圍內(nèi)。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的工作原理：抗體、熒光團(tuán)和細(xì)胞染料的重要性

為了通過流式細(xì)胞術(shù)分析特定靶標(biāo)，對(duì)細(xì)胞組分進(jìn)行熒光標(biāo)記。這可以通過使用單獨(dú)的熒光分子（例如，細(xì)胞染料）或熒光團(tuán)標(biāo)記的抗體（直接偶聯(lián)抗體或使用偶聯(lián)二抗）來完成。

流式細(xì)胞術(shù)中抗體的使用

抗體是許多生物檢測(cè)中的關(guān)鍵工具，在流式細(xì)胞術(shù)中也不例外。抗體具有特異性結(jié)合單個(gè)蛋白或蛋白修飾的能力，并且可作為一種方法來標(biāo)記那些用于進(jìn)行檢測(cè)的靶標(biāo)。通過標(biāo)記目的靶標(biāo)，研究人員可以評(píng)估各種細(xì)胞類型、疾病狀態(tài)、治療條件、發(fā)育階段或其他生物模型中蛋白的豐度或活性。

與不同蛋白結(jié)合的抗體不會(huì)相互干擾，因此，可以使用多種抗體同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)。這稱為多重分析。抗體數(shù)量的限制是獨(dú)立于其他抗體測(cè)定每種抗體的能力。在流式細(xì)胞術(shù)中，這種差分測(cè)定使用稱為熒光團(tuán)的熒光分子來完成。成功的實(shí)驗(yàn)要求具有高度特異性和經(jīng)驗(yàn)證的抗體以及可靠的熒光團(tuán)。

流式細(xì)胞術(shù)中熒光團(tuán)的使用

熒光團(tuán)的共同特性是能夠發(fā)射與用于照亮染料的光相比波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光。例如，如果使用藍(lán)色激光器來照亮稱為綠色熒光蛋白 (GFP) 的分子，那么蛋白會(huì)吸收藍(lán)光并發(fā)射綠光。被吸收的光與被發(fā)射的光之間的波長(zhǎng)差異稱為斯托克斯位移。

就是這種位移讓人們能夠準(zhǔn)確定量來自熒光團(tuán)的光，因?yàn)樗軌蜻^濾來自激發(fā)源的光的波長(zhǎng)。激發(fā)源總是比從正在分析的熒光團(tuán)中發(fā)射的熒光更亮些，并且如果這種光無法移除，那么它將會(huì)強(qiáng)烈影響檢測(cè)器。

熒光染料吸收的光的范圍稱為“激發(fā)"光譜，而激發(fā)時(shí)其發(fā)出的熒光稱為“發(fā)射"光譜。激發(fā)和發(fā)射光譜針對(duì)所有常見染料提供，并呈曲線顯示各波長(zhǎng)下吸收或發(fā)射的光量。

流式細(xì)胞術(shù)中的偶聯(lián)抗體：直接與間接熒光團(tuán)標(biāo)記

通常，在流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)中用于獲取讀數(shù)的熒光團(tuán)會(huì)與抗體共價(jià)結(jié)合。該過程稱為偶聯(lián)，并且該抗體-熒光團(tuán)配對(duì)稱為偶聯(lián)物。當(dāng)在一項(xiàng)細(xì)胞檢測(cè)中使用偶聯(lián)抗體時(shí)，熒光團(tuán)發(fā)射的光可作為細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞上存在的抗體量的一個(gè)直接指標(biāo)。（由于細(xì)胞膜是透光的，細(xì)胞內(nèi)熒光團(tuán)發(fā)射的光不會(huì)顯著衰減。）通過使用特異性結(jié)合蛋白或蛋白修飾的偶聯(lián)物，研究人員可以根據(jù)每個(gè)細(xì)胞發(fā)射的熒光水平，直接量化該細(xì)胞中的目的靶標(biāo)。該過程稱為直接檢測(cè)或直接流式細(xì)胞術(shù)。

直接：直接偶聯(lián)抗體

• 可直接多重分析來自同一宿主的抗體

• 由于孵育和洗滌步驟更少，因此實(shí)驗(yàn)步驟更快

• 能夠在一項(xiàng)檢測(cè)中使用許多不同的抗體，從而能夠同時(shí)讀取大量終點(diǎn)

間接：非偶聯(lián)一抗 + 偶聯(lián)二抗

• 可改善以低豐度存在的靶標(biāo)的檢測(cè)，同時(shí)由于二次放大可提供更高的靈敏度（多個(gè)二抗結(jié)合一個(gè)一抗）

• 當(dāng)直接偶聯(lián)物尚未獲得時(shí)，有益于一抗的初始驗(yàn)證

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