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15021010459實(shí)時(shí)熒光定量PCR
實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是一種由PCR技術(shù)發(fā)展而來(lái)的分子生物學(xué)技術(shù)，它可以通過(guò)在DNA擴(kuò)增過(guò)程中使用熒光染料來(lái)偵測(cè)每個(gè)PCR循環(huán)后產(chǎn)物的總量，具有PCR技術(shù)快速、靈敏的特點(diǎn)，同時(shí)還具有更高的特異性、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和可重復(fù)精確定量等優(yōu)勢(shì)。
qPCR化學(xué)原理-探針?lè)?/strong>
qPCR實(shí)驗(yàn)流程包括RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和qPCR。
探針?lè)╭PCR原理圖，源自網(wǎng)絡(luò)，侵刪
qPCR探針?lè)ㄊ且环N使用熒光探針來(lái)測(cè)量PCR產(chǎn)物的技術(shù)。在PCR反應(yīng)中，熒光探針會(huì)與PCR產(chǎn)物的特定序列結(jié)合，并發(fā)生熒光變化。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR產(chǎn)物的數(shù)量增加，熒光探針與PCR產(chǎn)物結(jié)合的數(shù)量也會(huì)隨之增加。通過(guò)測(cè)量熒光信號(hào)的強(qiáng)度，可以確定PCR產(chǎn)物的數(shù)量。
qPCR化學(xué)原理-染料法
qPCR染料法是一種使用DNA結(jié)合染料來(lái)測(cè)量PCR產(chǎn)物的技術(shù)。在PCR反應(yīng)中，DNA結(jié)合染料會(huì)與PCR產(chǎn)物的雙鏈DNA結(jié)合，從而發(fā)生熒光變化。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR產(chǎn)物的數(shù)量增加，DNA結(jié)合染料的熒光信號(hào)也會(huì)隨之增加。通過(guò)測(cè)量熒光信號(hào)的強(qiáng)度，可以確定PCR產(chǎn)物的數(shù)量。
染料法qPCR原理圖，源自網(wǎng)絡(luò)，侵刪
RNA提取
樣本采集與保存
RNA提取的第一步是樣本采集和保存。對(duì)于細(xì)胞和組織樣本，需要在采集后盡快進(jìn)行RNA提取，以避免RNA的降解。對(duì)于血液樣本，需要使用RNA穩(wěn)定劑或直接進(jìn)行RNA提取。另外，樣本的保存溫度和時(shí)間也需要根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行選擇。
樣本處理
樣本前處理是為了去除樣品中的細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、DNA等雜質(zhì)，從而提高RNA的純度。常見(jiàn)的樣本前處理方法包括離心、過(guò)濾和洗滌等。
樣本裂解
樣本裂解是將細(xì)胞膜破壞，使RNA釋放到溶液中的過(guò)程。常見(jiàn)的樣本裂解方法包括機(jī)械裂解、化學(xué)裂解和熱裂解等。
提取純化
RNA提取后，需要進(jìn)行純化并去除DNA、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。RNA純化試劑盒、硅膠柱和磁珠等方法都可以用于RNA提取后的純化。需要注意使用RNase-free試劑和器具，并在純化過(guò)程中避免RNA的降解。
質(zhì)量檢測(cè)
RNA提取后，需要進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)以確保RNA的完整性和純度。可以使用生物分析儀或瓊脂糖凝膠電泳等方法進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。
逆轉(zhuǎn)錄
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA的過(guò)程。將提取的RNA與逆轉(zhuǎn)錄酶、引物（如oligo(dT)或隨機(jī)引物）和dNTPs混合，在適宜的溫度下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度和時(shí)間需要根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄酶的不同而進(jìn)行選擇。
cDNA純化
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，需要將cDNA純化并去除RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶等雜質(zhì)。可以使用cDNA純化試劑盒或磁珠等方法進(jìn)行純化。
qPCR
引物設(shè)計(jì)
qPCR染料法的引物設(shè)計(jì)原則與其他PCR反應(yīng)的引物設(shè)計(jì)原則基本相同，主要考慮以下因素：
(1)引物長(zhǎng)度：通常為18-24個(gè)堿基對(duì)；
(2)引物Tm值：應(yīng)當(dāng)在55-65℃之間；
(3)引物特異性：應(yīng)當(dāng)避免與非目標(biāo)序列的互補(bǔ)；
(4)引物末端修飾：可以增強(qiáng)引物的特異性和穩(wěn)定性。
內(nèi)參選擇
內(nèi)參是用于校正樣品間差異的參照基因。內(nèi)參應(yīng)當(dāng)具有以下特點(diǎn)：
(1)在不同樣品中表達(dá)穩(wěn)定；
(2)與目標(biāo)基因同等易檢測(cè)；
(3)不會(huì)受到實(shí)驗(yàn)條件的影響。
常見(jiàn)的內(nèi)參包括GAPDH、Actin、Tublin等。
模板用量
確定qPCR實(shí)驗(yàn)中cDNA模板的稀釋度數(shù)需要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定最佳的稀釋倍數(shù)。以下是一些步驟：
(1)準(zhǔn)備一系列不同濃度的cDNA稀釋液，例如原液、1:10、1:100等；
(2)進(jìn)行qPCR反應(yīng)，并記錄Ct值；
(3)選擇Ct值在18-28范圍內(nèi)的稀釋倍數(shù)。
程序設(shè)置
在qPCR實(shí)驗(yàn)中，程序設(shè)置通常包括以下步驟（具體參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行）：
(1)預(yù)變性：95℃，5min；
(2)循環(huán)反應(yīng)：95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；40個(gè)循環(huán)。
注：循環(huán)反應(yīng)可分為兩步法和三步法。兩步法將常規(guī)PCR反應(yīng)中的退火、延伸步驟進(jìn)行合并，因此減少了反應(yīng)步驟、縮短了反應(yīng)時(shí)間。一般情況下，使用兩步法程序進(jìn)行擴(kuò)增即可滿足實(shí)驗(yàn)需求。如果模板濃度低或qPCR擴(kuò)增效率低時(shí)，可嘗試三步法反應(yīng)程序。
在分子生物學(xué)研究和臨床診斷領(lǐng)域，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)以其高靈敏度、高特異性和準(zhǔn)確性而成為不·可·或·缺的工具。
今天，給大家推薦一款專(zhuān)為丁型肝炎病毒（HDV）RNA設(shè)計(jì)的qPCR檢測(cè)利器——RoboGene HDV RNA Quantification Kit 2.0。
RoboGene HDV RNA 定量試劑盒 2.0 旨在使用即時(shí)病毒 RNA/DNA 試劑盒對(duì)人 EDTA 血漿或血清樣本中的丁型肝炎病毒 (HDV) RNA 進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR 定量。
雙重試劑盒版本
提供兩種不同的試劑盒版本，一種是用于LightCycler® 480和7500 Fast實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)的0.1 ml（白色）低輪廓試紙條，另一種是用于Rotor-Gene™ 3000/6000/Q的0.2 ml（透明）常規(guī)試管。
高靈敏度和寬線性范圍
手動(dòng)純化下的檢測(cè)限（LoD）為6 IU/ml，線性范圍從5至1x10^8 IU/ml，這表明試劑盒具有出色的靈敏度和寬泛的定量范圍。
廣泛的基因型覆蓋
能夠檢測(cè)1至8型HDV RNA，適用于全球不同地區(qū)流行的HDV基因型。
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