ProteanFect貼壁細胞轉染攻略|LX2轉染操作protocol

   ProteanFect 轉染試劑盒是全·球首·款自組裝蛋白納米顆粒核酸轉染試劑，專為難轉細胞系設計，能夠實現卓·越的外源基因遞送與表達。作為一種非病毒、非電轉、非脂質體的轉染試劑，ProteanFect可高效、低毒、簡便地將基因遞送至細胞中，尤其適用于大片段和多片段基因遞送。LX2細胞是一種人類肝星狀細胞的永生化細胞系，廣泛用于研究肝纖維化、肝損傷、肝臟疾病模型以及藥物篩選。LX2貼壁生長，呈上皮細胞樣。本文將詳細介紹如何使用ProteanFect轉染試劑盒實現LX2細胞的高效轉染。

LX2細胞的培養

生長培養基成分：DMEM培養基，含10% 胎牛血清和1%雙抗。

使用ProteanFect試劑盒轉染LX2細胞

1. 適合轉染的核酸類型：包括mRNA、siRNA和DNA。

2. 適合轉染的培養基：使用Opti-MEM培養基（或無血清DMEM培養基）進行轉染。提前預熱或恢復至室溫。

3. 配置ProteanFect轉染體系：具體詳見表1-3。轉染體系在配置過程中出現粘稠現象屬于正常。

4. 細胞準備：確保細胞處于良好生長狀態，活率需超過90%。調整細胞轉染密度時，避免反復離心，以免延長處理時間，影響細胞活力和轉染效率。

5. 細胞轉染：對于貼壁細胞，可消化成細胞懸液進行懸浮轉染，也可提前種板進行貼壁轉染。具體詳見表1。孵育時間建議保持在45-60分鐘，延長時間可能影響細胞活力。

6. 轉染效率與細胞活率檢測：使用陽性對照mRNA時，可在轉染后5-48小時內觀察EGFP的表達。細胞活率可通過鏡下觀察、臺盼藍染色或流式細胞術等方法檢測，若細胞狀態良好，鏡下觀察可見細胞呈現抱團生長狀態。

a.ProteanFect轉染體系在配置過程中可能會出現一定的粘稠現象，屬于正常情況。

b.孵育時間可根據不同細胞類型有所調整，建議孵育時間不超過2小時。

c.使用陽性對照mRNA時，可在轉染后5-48小時內觀察到EGFP的表達。

a.建議mRNA濃度≥1 μg/μL。如需同時轉染多個mRNA，為確保在轉染多個mRNA時保持高效的轉染效果，加入的mRNA總量為0.5 µg。

b.建議siRNA濃度≥20 μM。如需同時轉染多個siRNA，為確保在轉染多個siRNA時保持高效的轉染效果，加入的siRNA總量為40 pmol。

c.建議DNA濃度≥0.5 µg/µL；如需同時轉染多個DNA，為確保在轉染多個DNA時保持高效的轉染效果，加入的DNA總量不超過0.4 µg。同時，轉染效率受DNA質量影響，建議使用無內毒素試劑盒制備DNA，并確保OD值在1.7-1.9之間。使用無核酸酶純水將DNA稀釋至0.5-2 µg/µL的濃度，以提高轉染效果并降低細胞毒性。

使用ProteanFect試劑盒轉染LX2細胞實例

（1） 轉染步驟

（2） 結果分析

在轉染 EGFP mRNA或GFP pDNA后，可通過熒光顯微鏡和流式細胞術對細胞轉染后的細胞活力與轉染效率進行分析。首先通過熒光顯微鏡對轉染后LX2細胞的EGFP蛋白質表達、細胞形態和活力進行定性評估（圖 1）。同時，收集轉染后的細胞進行流式檢測以定量分析其轉染效率。細胞收集完成后，離心棄去培養基，用1 × DPBS重懸細胞，進行流式檢測（圖2，圖3）。

圖1. 利用ProteanFect貼壁轉染LX2細胞，EGFP mRNA轉染后24小時和GFP pDNA轉染后48小時的表達熒光圖。

圖2. 利用ProteanFect貼壁轉染LX2細胞，EGFP mRNA轉染后24小時和GFP pDNA轉染后48小時的表達流式分析圖。

圖3. 利用ProteanFect懸浮轉染LX2細胞，EGFP mRNA轉染后24小時和GFP pDNA轉染后48小時的表達流式分析圖。

常見問題

1. 如何提升轉染效率

延長轉染時間：根據細胞狀態適當延長轉染時間，通常不超過2小時。

2. 質粒DNA轉染要求

轉染效率受DNA質量影響。建議使用無內毒素試劑盒制備DNA，并確保OD值在1.7-1.9之間；使用無核酸酶純水將DNA稀釋至0.5-2 µg/µL的濃度。

3. 細胞系轉染前處理

1）為獲得良好的轉染效率，建議使用活性超過90%的細胞，可以通過臺盼藍染色測定細胞活性。2）不建議使用傳代次數超過15次的細胞進行實驗。3）新復蘇的細胞在轉染實驗前需傳代2-3次，待細胞恢復正常生長后使用。

4. 關于試劑盒中陽性對照的使用建議

首·次嘗試時，建議設置陽性對照組（EGFP mRNA和GFP pDNA），以檢測實驗操作和試劑的有效性。使用96孔板的細胞量即可，節省細胞和試劑。

5. 轉染時的細胞數范圍

說明書中提供了最佳轉染條件下的細胞數量范圍，但在特殊情況下，如細胞較大，可根據細胞大小降低細胞數以匹配相應培養皿。如果細胞數量較少，也可以進行轉染。以96孔板為例，建議細胞數量不低于4×103/孔，以確保后續檢測的可靠性。

6. 轉染后細胞狀態與活力

轉染后，細胞狀態可能與未處理組略有差異。但使用ProteanFect試劑進行轉染時，對細胞活力的損傷較小。通常在轉染后第二天，細胞狀態會基本恢復。

7. 轉染后細胞離心后看不到沉淀

對于小體積轉染體系（如96孔板），離心后細胞沉淀不明顯是正?，F象。細胞沉淀可能散落在離心管側壁，不影響后續結果。為減少細胞損失，離心后移液時應避免槍頭緊貼底部。

8. 轉染體系擴大是否影響轉染效率

如轉染細胞量較大，推薦使用離心管進行孵育，轉染體系參照表3，不會影響轉染效率。

ProteanFect試劑盒類型及適用細胞系

現有的六款轉染試劑盒：

1. PT01--ProteanFect 轉染試劑盒

2. PT02--ProteanFect Max轉染試劑盒

3. PT03--ProteanFect Max小鼠原代免疫細胞轉染試劑盒

4. PT04--ProteanFect CRISPR Cas9基因編輯轉染試劑盒

5. PT05--ProteanFect CRISPRMax Cas9基因編輯轉染試劑盒

6. PT06-ProteanFect CRISPRMax Cas9小鼠原代免疫細胞基因編輯轉染試劑盒

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