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    造血干細胞培養基的培養步驟及注意事項

    更新時間:2014-03-28 點擊次數:1924
    造血干細胞培養基的培養步驟
    1、胚胎成纖維細胞的復蘇:胚胎干細胞一般是在37℃、5%CO2和95%濕度的培養條件下,生長在鋪有一層滋養細胞層的細胞培養皿或者是細胞培養瓶中(此處以細胞培養皿為例)。因此要先鋪滋養層細胞。在37℃水浴鍋里快速融化一管液氮凍存的小鼠胚胎成纖維細胞。把融化的細胞懸浮液加到裝有幾毫升預熱好的MEF培養基的無菌離心管中,輕輕混勻后,1000×g ,5min離心收集細胞。吸掉上清(除去凍存液中的DMSO),用10ml預熱的MEF培養基重懸細胞后,加到一個10cm的細胞培養皿中,放入37℃,含有5%CO2的加濕培養箱中培養。根據情況對細胞進行換液,大約4天左右,細胞就可以基本長滿整個培養皿,這時可以進行傳代、凍存或用于制備滋養細胞層。
    2、滋養細胞層的制備:把長好的小鼠胚胎成纖維細胞的培養基吸掉,加入10ml新鮮的MEF培養基,并在避光的條件下加入110μl配好的絲裂霉素C,混勻后放入培養箱培養2h。把含有絲裂霉素C的培養基用無菌的15ml離心管收集起來避光保存,在一周之內可再次使用(直接使用該培養基處理細胞5h)。用PBS(不含二價離子)洗滌細胞2到3次后,用1ml含有EDTA的胰酶消化細胞,37℃培養箱放置約3min,直到細胞懸浮起來。用1ml MEF培養基中和胰酶的作用,之后把細胞收集到離心管里,1000×g離心5min。去掉上清,用1ml MEF培養基重懸細胞,之后把細胞平均分到兩個經過0.1%明膠處理過的細胞培養皿
    中,用MEF培養基培養細胞。(明膠處理:加5ml 0.1%的明膠到細胞培養皿中,在37℃培養箱中至少放置10min,之后把明膠吸掉即可)。一般處理好的小鼠胚胎成纖維細胞在1~2h之后即可以貼壁,形成滋養細胞層,這時的滋養細胞層即可
    用來培養小鼠胚胎干細胞。制備好的滋養細胞層可以在MEF培養基中保持1周左右的時間,或者是把細胞凍存。
    3、小鼠胚胎干細胞(mouse embryonic stem cells,ES cells)的復蘇
    4、小鼠胚胎干細胞的傳代
    5、小鼠胚胎干細胞的凍存
    造血干細胞培養基的培養注意事項:
    1、絲裂霉素C在操作時要避光,避免其分解。
    2、ES細胞傾向于聚集生長,因此在復蘇時,要選擇好培養皿的規格
    3、ES細胞不能長的太滿,應避免使各個克隆之間接觸,以免發上分化。
    4、為避免水或血清帶來的污染,對血清應進行支原體檢測,配好的培養基要進行污染測試。

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