Roche 11585432910 原位細胞凋亡檢測試劑盒, POD 華雅干細胞*

英文名稱：In Situ Cell Death Detection Kit, POD
產品應用：借助光學顯微鏡定性檢測單細胞水平細胞凋亡
中國俗稱：原位細胞凋亡檢測試劑盒  中國簡稱：  凋亡細胞檢測試劑盒
注冊品牌：Roche  生產廠家：  Roche公司
訂購貨號：11684817910
規格型號：50 Tests
保存溫度：-15～-25℃
產品種類：細胞凋亡檢測
到貨時間：1～5 天
英文名稱：In Situ Cell Death Detection Kit, POD
中文名稱：原位細胞凋亡檢測試劑盒, POD

檢測原理：原位細胞凋亡檢測試劑盒基于對細胞凋亡早期發生的單鏈和雙鏈DNA斷裂的檢測。凋亡細胞被固定和滲透。隨后，這些細胞和TUNEL反應混合物（包含TdT和熒光素-dUTP）一起孵育。孵育期間，TdT催化熒光素-dUTP標記的游離3’-OH添加到單鏈和雙鏈DNA中。清洗后，標記物包含在DNA斷裂位點處，并被抗熒光素抗體結合物識別標記（報告酶過氧化物酶）。清洗去除未結合的酶配體，POD保留在免疫復合物中，可通過底物反應觀察到。

樣本材料：細胞離心涂片器和細胞涂片制備，載玻片上生長的貼壁細胞，冷凍和蠟包被的組織切片

產品特點：
靈敏：zui大凋亡細胞標記強度（細胞染色），比缺口平移要高
快速：熒光素-dUTP標記使其在TUNEL反應結束后直接可進行樣本分析（2-3 h）
方便：使用熒光素d-UTP直接標記法可在檢測時確認TUNEL反應效率
準確：可在分子水平（DNA鏈斷裂）鑒定極早期凋亡細胞
靈活：不包含底物；可選擇不同染色方法

產品成份：
• 酶溶液（TdT）
• 標記溶液（熒光素-dUTP）
• 媒介物POD（抗-熒光素抗體-POD），即開可用

訂購信息：
› 11684795910 In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein, 50 Tests
› 11684809910 In Situ Cell Death Detection Kit, AP, 50 Tests
› 11684817910 In Situ Cell Death Detection Kit, POD, 50 Tests

In Situ Cell Death Detection Kit, POD
11684817910
1 kit for up to 50 tests

    Sensitive: The maximum intensity of labeling (cell staining) of apoptotic cells is higher than the nick translation method
    Fast: The use of fluorescein-dUTP allows analysis of the samples directly after the TUNEL reaction, but before the addition of the secondary detection system
    Convenient: The direct labeling procedure using fluorescein-dUTP allows verification of the efficiency of the TUNEL reaction during the assay procedure
    Accurate: Identification of apoptosis at a molecular level (DNA-strand breaks) and identification of cells at the very early stages of apoptosis
    Flexible: No substrate included; provides the opportunity to select the staining procedure of choice

產品名稱： 細胞凋亡檢測試劑盒POD法
英文名稱：In Situ Cell Death POD
產品貨號： 11684817910
細胞凋亡檢測試劑盒POD法

                                  
產品編號     品名/ Packsize的
11684817910  

在原位細胞凋亡檢測試劑盒，過氧化物酶
1包（高達50測試）

優點

    敏感：細胞凋亡（細胞染色）標簽的zui大強度高于缺口翻譯方法
    快速：使用熒光的dUTP允許后直接TUNEL反應，但在此之前的二次檢測系統除了對樣品的分析
    方便：直接標記程序，使用熒光素-dUTP標記允許在檢測過程中的TUNEL反應效率的核查
    準確：在分子水平（DNA鏈斷裂）和細胞凋亡的早期階段的細胞識別凋亡鑒定
    靈活：無基板;提供了選擇的機會，選擇染色過程

 
產品描述

樣品材料：細胞離心涂片和細胞涂片準備，在幻燈片上生長的貼壁細胞，冷凍和石蠟包埋的組織切片。
 
背景資料

廣泛使用的方法，以確定細胞凋亡的基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳和DNA段分析基于分析3 H -胸苷，另外，5 -溴-2'-脫氧尿苷。該方法涉及從零散，低分子量的DNA不分段，高分子量的DNA分離在一個特定的細胞群。因此，這些方法并不在一個特定的細胞群提供單個細胞的命運的信息，特別是在組織切片。另外，個別細胞凋亡可能顯微鏡確認，因為核染色質凝聚和碎裂的外觀特征，但這種方法是主觀的，不限于一個相對狹窄的時間窗口時的形態學變化zui大的是細胞凋亡的特點是DNA降解，這是有選擇性的DNA鏈接的internucleosomal地區處于早期階段。可能產生DNA斷裂雙鏈和單鏈DNA斷裂（尼克斯）。兩種類型的休息可以自由3'-OH末端修飾核苷酸標記（例如在酶催化反應，生物素-dUTP標記，地高辛-dUTP標記，熒光的dUTP）檢測。末端轉移酶（TDT）催化脫氧模板獨立聚合單和雙鏈DNA的3'-末端。這種方法也被稱為TUNEL法（牛逼 ð ü DT-介導的TP-X的列印 ICK é ND 升abeling）。另外，自由3'-OH基團，可使用DNA聚合酶標記通過名為尼克翻譯的模板依賴的機制。然而，TUNEL法被認為是更敏感和更快捷。

roche 11684817910中文操作說明書
一、 原理：

TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素（fluorescein）標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的熒光素抗體特異性結合，后者又與HRP底物二氨基聯苯胺（DAB）反應產生很強的顏色反應（呈深棕色），特異準確地定位正在凋亡的細胞，因而在光學顯微鏡下即可觀察凋亡細胞；由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3‘-OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞涂片）在單細胞水平上的凋亡原位檢測。還可應用于抗腫瘤藥的藥效評價，以及通過雙色法確定細胞死亡類型和分化階段。

二、 器材與試劑

器材：光學顯微鏡及其成像系統、小型染色缸、濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規格的加樣器及槍頭等；

試劑：試劑盒含TdT 10×、熒光素標記的dUTP 1×、標記熒光素抗體的HRP；自備試劑：PBS、雙蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（臨用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8）或細胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，臨用前配制）、蘇木素或甲基綠、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。

三、 實驗步驟

操作流程圖：制作石蠟切片→脫蠟、水合→細胞通透→加TUNEL反應液→加converter-POD→與底物DAB反應顯色→光學顯微鏡計數并拍照。

具體操作步驟（石蠟包埋切片的檢測）：

1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min；

2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；

注：上面兩步是針對石蠟切片樣本的處理

4. 用Proteinase K工作液處理組織15-30 min 在21–37°C（溫度、時間、濃度均需摸索）或者加細胞通透液8min；

5. PBS漂洗2次；

6. 制備TUNEL反應混合液，處理組用50μl TdT+450μl 熒光素標記的dUTP液混勻；而陰性對照組僅加50μl 熒光素標記的dUTP液，陽性對照組先加入100μl DNase 1，反應在15~25℃×10min，后面步驟同處理組。

7. 玻片干后，加50μl TUNEL反應混合液（陰性對照組僅加50μl 熒光素標記的dUTP液）于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×1h。

8. PBS漂洗3次；

9. 可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計數凋亡細胞（激發光波長為450~500nm，檢測波長為515~565nm）；

10. 玻片干后加50μl converter-POD于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×30min。

11. PBS漂洗3次；

12. 在組織處加50~100μlDAB底物，反應15~25℃×10min；

13. PBS漂洗3次；

14. 拍照后再用蘇木素或甲基綠復染，幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

15. 加一滴PBS或甘油在視野下，用光學顯微鏡觀察凋亡細胞（共計200~500個細胞）并拍照。可結合凋亡細胞形態特征來綜合判斷（未染色細胞變小，胞膜完整但出現發泡現象，晚期出現凋亡小體，貼壁細胞出現鄒縮、變圓、脫落；而染色細胞呈現染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質分割成塊狀/凋亡小體）

對于.培養細胞的預處理：
①在載玻片上鋪一層薄薄的多聚賴氨酸（見備注4），干燥后在去離子水中漂洗，干燥后4℃保存；
②適當方法誘導細胞凋亡，同時設未經誘導的對照組，各組離心收集約1×106個細胞，PBS洗一次，重懸，加到鋪好的多聚賴氨酸載玻片上，自然干燥，使細胞很好的吸附到載玻片上；
③將吸附細胞的載玻片在4%多聚甲醛（見備注2）中固定25min；
④PBS浸洗二次，每次5min；
⑤將吸附細胞的載玻片在0.2%的Triton X-100（見備注5）中處理5min；
⑥PBS浸洗二次，每次5min；

后續操作如同石蠟包埋切片的6—15

四、 注意事項

1. 進行PBS 清洗時，每次清洗5 min。

2. PBS清洗后，為了各種反應的有效進行，請盡量除去PBS 溶液后再進行下一步反應。

3. 在載玻片上的樣本上加上實驗用反應液后，請蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進行，這樣可以使反應液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應液干燥造成實驗失敗。

4. TUNEL反應液臨用前配制，短時間在冰上保存。不宜長期保存，長期保存會導酶活性的失活。

5. 如果20×DAB 溶液顏色變深成為紫色，則不可使用，需重新配制。

6. 用甲基綠（Methyl Green）染液（3-5%甲基綠溶于0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0）染色后，請用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠。然后進行洗凈（100%乙醇）、脫水（二甲苯）透明、封片后通過光學顯微鏡觀察操作。如果此時使用80~90%的乙醇洗凈時，甲基綠比較容易脫色，注意快速進行脫水操作。

7. 熒光素標記的dUTP液含甲次酸鹽和二氯鈷等致癌物，可通過吸入、口服等途徑進入機體，注意防護。

8. 試劑保存；未打開的試劑盒貯存在-20℃（-15~25℃）；converter -POD液一旦解凍，以后就保存在4℃（2~8℃）下，至少在6 m內穩定，避免再次凍存；TUNEL反應液臨用前配好后，放至冰上直至使用。

9. 結果分析時注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細胞中可產生大量DNA斷，從而引起假陽性結果；而有些類型的凋亡性細胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不*，以及細胞外的矩陣成分阻止TdT進入胞內反應，進而產生假陰性結果。